电穿孔是利用施加外部电场而形成亲水孔的过程,通过形成“临时通道”可将药物加载到外泌体中,外泌体膜完整性很快会恢复。电穿孔的参数易于控制,可将各种“货物”加载入外泌体中。最常用的是将小分子干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)加载入外泌体中,因为外泌体中天然携带各种RNA。Alvarez-Erviti 等通过电穿孔将siRNA加载到树突状细胞(dendritic cell,DC)分泌外泌体中并成功运输siRNA至大脑中。Hood等[29]研究表明电穿孔加载RNA效率优于被动装载。迄今为止,RNA已成功加载到外泌体中,且被证明可广泛应用。但几乎没有报道外泌体负载DNA的潜在用途。Lamichhane 等证明可通过电穿孔加载DNA并传递至受体细胞的能力,且当DNA为线性、长度小于1 000bp与外泌体结合效率更高,同时外泌体本身的大小也影响DNA装载效率。有研究人员表明电穿孔会导致siRNA聚集,使得通过电穿孔加载药物到外泌体效率可能被高估。
1.3 外泌体转染
利用市售的转染试剂已经显示可有效地将siRNA加载到外泌体并成功传递至受体细胞。在Stham等经研究,将RAD51、RAD52与脂质体转染试剂一起掺入外泌体中。他们证实了通过载有RAD51 siRNA的外泌体成功使癌细胞中RAD51基因沉默。Familtseva等将siRNA转染到外泌体中并成功递送至受体细胞的过程可视化,使用转染试剂将带有红色荧光标记的siRNA转染至小鼠主动脉内皮细胞(mouse aortic endothelial cell ,MAEC)产生的外泌体中;最后与MAEC细胞孵育,发现荧光标记的siRNA成功递送至MAEC中,证实了基于转染的有效性。 但该研究表明与电穿孔相比,装载效率低,此外无法从剩余的试剂中鉴定出负载siRNA的外泌体。考虑到化学转染的潜在毒性,基于转染的方法可能不适用于临床治疗。
2 改造供体细胞
2.1 供体细胞活化
尽管用药物处理供体细胞,使供体细胞活化而收获分泌载有药物的外泌体不是临床应用中最合适的选择,却反映了外泌体生理中独特的现象。 据Lv等[34]报道,将HepG2细胞与不同抗癌药物(依托泊苷、卡铂、伊立替康、PTX)孵育后,从HepG2细胞中释放的外泌体对人胰腺癌细胞系CFPAC-1表现出强大的抗增殖活性,并诱导了基于热休克蛋白免疫原性和特异性的NK细胞杀伤效应。另一项研究表明,将姜黄素与RAW 264.7细胞共同孵育产生的外泌体在通过血脑屏障后激活蛋白激酶B/糖原合成酶激酶-3(protein kinaseB/glycogen synthasekinase3β,AKT/GSK-3β)通路,抑制Tau蛋白磷酸化,防止神经元死亡,从而缓解阿尔兹海默病的症状。
2.2 供体细胞转染
到目前为止,将治疗性药物装载到外泌体中最广泛应用的方法是转染产生外泌体供体细胞。随后供体细胞中可过表达特定基因,并将其包裹在外泌体内或外泌体膜上[35]。将miRNA-144转染到骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)中产生的负载miRNA-144的外泌体,通过靶向同源性磷酸酶张力蛋白/磷酸化蛋白激酶B(phosphate and tesion homology deleted on chromosome ten/phosphorylated protein kinase B,PTEN/AKT)通路改善缺氧条件下的心肌细胞凋亡。在HEK293T细胞中过表达miRNA-29,分离出的外泌体囊泡可抑制胃癌血管生成。用miRNA-214抑制剂转染HEK293T细胞,分泌的Exo-anti-214可以逆转胃癌的耐药性。转染存在细胞毒作用会带来潜在的毒副作用,以及存在特异性差和包装效率低的限制,未来需要进一步研究验证其可能存在的问题,才能将该技术利用于临床中。
3 新颖的外泌体装载方式
当下外泌体载药模式各不相同,但低效率和复杂的纯化技术带来进一步应用限制。最近,已报道通过光学可逆的蛋白质-蛋白质相互作用进行蛋白质加载外泌体,作为一种新型的蛋白质载体,可克服传统方法缺陷。将货物蛋白质与感光体隐色素2(cryptochrome 2,CRY2)蛋白质融合,并将与CRY相互作用的基本螺旋-环-螺旋1(cryptochrome-interacting basic-helix-loop-helix1,CIB1)蛋白质锚定到与膜相关的四跨膜蛋白CD9上。蓝光促进CRY2和CIB1的可逆蛋白相互作用,从而使货物蛋白附着到膜上,并通过内源性生物发生将货物掺入外泌体。去除照明源会破坏CRY2-CIB1的相互作用,将蛋白质货物释放到外泌体的腔内空间,从而能够通过胞吐作用将货物进一步施用于受体细胞的细胞质。
CRISPR/Cas9系统被认为是最具前途的基因编辑和调控技术,目前还没有一种安全有效地体内给药方法。由于外泌体尺寸较小,通过外泌体包装大分子核酸效率非常低下,迫切需要开发出新的载药方式。研究人员发现脂质体不能单独转染至MSC细胞中,而脂质体与CRISPR/Cas9表达载体结合再装载入外泌体,杂化的外泌体被MSC细胞吞噬后表达。这项技术可能对于有些治疗性货物装载入外泌体提供新的思路。
参考文献
吴忧, 辛林. 新的药物传递系统:外泌体作为药物载体递送* [J]. 中国生物工程杂志, 2020, 40(9): 28-35返回搜狐，查看更多